Kit di Estrazione DNA/RNA Virus

Il Kit di Estrazione dell'Acido Nucleico Virale II è stato progettato specificamente per la purificazione efficiente del DNA virale e dell'RNA virale da campioni privi di cellule come siero, plasma, fluidi corporei e il sopranatante di colture cellulari virali infette. L'efficiente sistema di colonnina di spin in fibra di vetro è ottimizzato per la purificazione dell'acido nucleico da un'ampia varietà di virus sia DNA che RNA come HBV, CMV, HCV, HIV e HTLV. È possibile purificare 101-109 copie di DNA/RNA virale da un massimo di 200 µl di campioni entro 20 minuti. Il DNA/RNA virale purificato può essere utilizzato direttamente nei test qPCR e qRT-PCR.

Figura 1. L'RNA del virus è stato purificato dal numero di copie 10E1-10E4 del Virus della Necrosi Nervosa delle Cernie a Chiazze Rosse (RGNNV) utilizzando il kit DNA/RNA Virale (3 repliche di ogni numero di copia). L'RNA purificato è stato diluito con 30 μl di acqua priva di RNasi. La sintesi del cDNA è stata effettuata con un'aliquota di 10 μl di RNA purificato utilizzando un Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) in un volume finale di 20. È stato quindi eseguito un test PCR in tempo reale con 3 μl di cDNA sintetizzato come modello, primer (progettati per amplificare la regione T4 sul segmento RNA2) e il reagente Fast SYBR Green PCR Master Mix utilizzando il sistema di PCR StepOnePlusTM Real-Time (di Applied Biosystems). I risultati hanno confermato che l'RNA del virus può essere estratto con successo e rilevato a partire da un numero di copie di RGNNV pari a 10E1. La soglia del ciclo medio (Ct): 10E4 = 23.88, 10E3 = 27.72, 10E2 = 31.22, 10E1 = 34.62. I bassi valori di Ct indicano un alto numero di acido nucleico target nel campione.

Figura 2. L'RNA del virus dell'Epatite A (HAV) è stato estratto utilizzando il Kit di Estrazione dell'Acido Nucleico Virale. L'RNA purificato è stato analizzato mediante elettroforesi su un gel di agarosio all'1%.
M: Scala del DNA 1 Kb

1: HAV da siero originale

2: HAV da siero diluito 10X

3: HAV da siero diluito 100X

Figura 3. HBV (DNA), HCV (RNA), HIV (RNA), e HTLV (RNA) sono stati purificati da 200 µl di campioni di siero clinico positivo utilizzando il Kit di Estrazione dell'Acido Nucleico Virale II. Le reazioni qPCR in tempo reale e qRT-PCR 1 fase sono state quindi condotte utilizzando il Sistema di Rilevamento delle Sequenze ABI 7300 (3 repliche di ogni numero di copia). Sono stati individuati e identificati con successo campioni di siero contenenti varie quantità di DNA/RNA virale che vanno da 10E1 a 10E6 copie/ml. I bassi valori Ct indicano un alto numero di acido nucleico target nel campione.