1.

TMB सबस्ट्रेट सॉल्यूशन दूषित/कंटामिनेट हो गया था

ताजा टीएमबी सब्सट्रेट सॉल्यूशन का उपयोग करें जो वेल में डालने से पहले पहले साफ़ और रंगहीन होना चाहिए। वेल में सब्सट्रेट सॉल्यूशन की पिपेटिंग से पहले एक साफ V तली वाले कंटेनर का उपयोग करें। वेल में सब्सट्रेट सॉल्यूशन की पिपेटिंग से पहले एक साफ V तली वाले कंटेनर का उपयोग करें।

2.

प्रतिक्रिया नहीं रोकी गई

अगर सब्स्ट्रेट प्रतिक्रिया को नही रोका जाता है तो रंग बढ़ता रहेगा।

3.

प्लेट को प्लेट रीडर में रीड करने से पहले काफी देर तक रखा गया

(भले ही स्टॉप सॉल्यूशन मिला दिया गया हो हालांकि धीमी दर से) रंग बढ़ता रहेगा।

4.

लैब के ग्लासवेयर पर दूषित पदार्थ होना

सुनिश्चित करें कि रिएजेंट फ्रेश हैं और साफ ग्लासवेयर में बनाए गए हैं

5.

सब्सट्रेट का इन्क्यूबेशन प्रकाश में किया गया

सब्सट्रेट का इन्क्यूबेशन अंधेरे में होना चाहिए। सुनिश्चित कर लें कि सब्सट्रेट प्रकाश में नहीं है—अँधेरी जगह में स्टोर करें। परीक्षण करते समय प्रकाश से बचाएँ।

6.

वेल का कम धुला/वॉश होना

वैलों को प्रोटोकॉल के सुझावानुसार वॉश करें।

7.

बहुत ज्यादा डिटेक्शन रिएजेंट डाला गया हो

सुनिश्चित कर लें कि रिजेंट ठीक से डाइल्यूट किया हुआ है या डिटेक्शन रिएजेंट का सुझाई गई कंसंट्रेशन घटा दें।

8.

अप्रभावी ब्लॉकिंग बफर (जैसे डिटेक्शन रिएजेंट ब्लॉकर से बाइंड कर जाता है; वेल पूरी तरह से ब्लॉक नही हुए हैं)

अन्य ब्लॉकिंग रिएजेंट आजमायें और/या वॉश बफर में ब्लॉकिंग रिएजेंट डालें।

9.

इन्क्यूबेशन/वॉश बफर की सॉल्ट कंसंट्रेशन

सॉल्ट कंसंट्रेशन बढ़ाने पर नॉन-स्पेसिफिक और/या वीक ऑफ-टारगेट इंटरेक्शन घट सकता है।

10.

एंटीबॉडी की ज्यादा मात्रा

अनुकूल/ऑप्टिमम परिणामों के लिए अलग डायल्यूशन आजमाएं।

11.

सब्स्ट्रेट के मिलाने पर वेल में प्रेसिपिटेट बन जाना

सैंपल का डायल्यूशन फैक्टर बढ़ाएं या सब्स्ट्रेट की मात्रा घटाएं।

12.

गन्दी प्लेट

प्लेट की तली को साफ करें।

13.

स्टैंडर्ड ग्राफ के डायल्यूशन को गलत बनाना

अपनी पिपेट की तकनीक को चेक करें। पिपेट के कैलिब्रेशन की जरूरत हो सकती है।

14.

सुझाव से ज्यादा देर तक इंक्यूबेट करना

अपने इक्यूबेशन समय का सही होना सुनिश्चित करें और तकनीक मैनुअल के साथ दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करें।

15.

प्लेट सीलर या रिएजेंट रिजरवॉयर को दोबारा उपयोग किए जाने पर, HRP बची रह जाती है। इससे TMB नॉन-स्पेसिफिक रूप से नीला हो जाता है।

प्लेट सीलर को फिर से उपयोग करने पर बची हुई HRP उपस्थित हो सकती है, TMB नॉन-स्पेसिफिक रूप से रंग बदल सकता है। इससे बचने के लिए प्रत्येक चरण के लिए फ्रेश प्लेट सीलर और रिएजेंट रिजरवॉयर उपयोग करें।

16.

बफर का दूषित/ कंटामिनेशन होना

हमेशा बफर फ्रेश बनाएं।

17.

सैंपलों में एनालाइट बिल्कुल नहीं या डिटेक्शन लेवल से नीचे हैं

यदि सैंपल डिटेक्शन लेवल से कम हैं, तो ज्यादा वॉल्यूम उपयोग करना संभव हो सकता है। प्रोटोकॉल के सही बदलाव के लिए तकनीकी सहायता से बात करें।

18.

सैंपल में एनालाइट की मात्रा अधिकतम स्टैंडर्ड पाँइंट से अधिक है

सैंपल को और डायल्यूट करना पड़ सकता है।

19.

कम वॉशिंग

सही वॉशिंग प्रक्रिया उपयोग करें—नीचे देखेँ। हर वॉशिंग चरण के अंत में प्लेट को अब्सोर्बेंट टिश्यू पर उल्टा करें और पूरी तरह से निकल जाने दें, यदि जरूरी हो तो बचे हुए तरल को निकालने के लिए टैप करें।

20.

प्लेट सीलर का उपयोग नहीं किया या फिर से उपयोग किया गया

इंक्यूबेशन के दौरान, परीक्षण प्लेट को प्लेटसीलर से कवर करें। हर बार प्लेट के खुलने पर फ्रेश सीलर का उपयोग करें। इससे वेल में आपस में कंटामिनेशन होने से बचेगा।

21

गलत डायल्यूशन बनाए गए

पिपेटिंग तकनीक चेक करें—नीचे देखें—और गणनाओं को ठीक से चेक करें।

22.

अनुशंसित से लंबा इन्क्यूबेशन समय

बनाई गई किट में ऑप्टिमाइज प्रोटोकॉल होता है। सुझाए गए इंक्यूबेशन समय का उपयोग करना सुनिश्चित करें। यदि डवलपमेंट एलिसा किट एंटीबॉडी की जोड़ी उपयोग कर रही है तो आपको परीक्षण को ऑप्टिमाइज करना पड़ सकता है। अधिक जानकारी के लिए एलिसा डवलपमेंट और ऑप्टिमाइजेशन देखें।

23.

सब्स्ट्रेट सॉल्यूशन बहुत जल्दी मिला दिया और नीला पड़ गया

सब्सट्रेट सॉल्यूशन को तुरंत मिलाना और इस्तेमाल करना चाहिए

24.

बहुत ज्यादा स्ट्रैप्टाविडिन-HRP

डायल्यूशन चेक करें, अगर जरूरी हो तो टाइट्रेट करें

25.

प्लेट सीलर या रिएजेंट रिजरवॉयर को फिर से उपयोग किया गया, इससे बची हुई HRP रह जाती है। इससे TMB नॉन-स्पेसिफिक रूप से नीला हो जायेगा

प्रत्येक चरण के लिए फ्रेश प्लेट सीलर और रिजरवॉयर का उपयोग करें

26.

बफर धातु या HRP से दूषित/कंटामिनेट हो गया

फ्रेश बफर बनाएं

27.

मल्टीचैनल पिपेट की त्रुटियाँ

पिपेट को कैलिब्रेट करें

28.

प्लेट की वॉशिंग अपर्याप्त या एक समान न होना

सुनिश्चित करें की पिपेट की टिप काफी मजबूती से लगी हुई हैं कन्फर्म करें कि सभी वॉश चरणों में सभी रिएजेंट पूरी तरह से हटाए गए

29.

नॉन-होमोजिनस सैंपल

पिपेटिंग करने से पहले सैंपल को अच्छे से मिला लें

30.

सैंपल में अत्यधिक कण हो सकते हैं

सेंटरीफ्यूगेशन (centrifugation) से कणों को हटा दें

31.

प्लेट को अपर्याप्त हिलाना

एलिसा के सभी इन्क्यूबेशन चरणों के दौरान प्लेट को एलिसा प्लेट शेकर को
उपयोग करके उतनी स्पीड से हिलाया जाना चाहिए ताकि वेल में सोल्यूशन बिना गिरे लगातार घूमता रहे

32.

एक दूसरे से वेल से दूषित होना

प्लेट सीलर का फिर से उपयोग करने से पहले चेक कर लें कि सीलर पर कोई रिएजेंट न छुआ हो। रिएजेंट डालने के लिए एक ही पिपेट टिप इस्तेमाल करते समय सावधानी बरतें। सुनिश्चित कर लें कि पिपेट टिप प्लेट पर किसी रिएजेंट को न छुए।

33.

प्लेट को इन्क्यूबेशन के दौरान स्टैक में रखा गया

प्लेट को स्टैक में रखने से प्लेट के वेल में तापमान एक समान नहीं जाता है। स्टैक में न रखें।

34.

ख़राब पिपेट

सुनिश्चित कर लें कि पिपेट सही काम कर रही हैं और कैलिब्रेट की गई हैं। सुनिश्चित कर लें कि उनकी टिप अच्छी सील बनाने के लिए काफी दबाई हुई हैं। प्लेट डाइल्यूट करते समय सावधानी बरतें और देखते रहें कि पिपेट की टिप सही से तरल पदार्थ को सही मात्रा में उठा और डाल रही हैं।

35.

एंटीबॉडी के डायल्यूशन/रिएजेंट को मिलाया नहीं गया

सभी वेल में एक जैसी/सुसंगत सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए, सभी रिएजेंटों/अभिकर्मकों और सैंपलों की प्लेटों पर पिपेटिंग से पहले मिश्रित किया जाना सुनिश्चित करें।

36.

वेल सूख गए

सुनिश्चित करें कि इन्क्यूबेशन के दौरान प्लेटों पर लिड लगी रहने दें । इनक्यूबेटर के तल में एक ह्यूमिडीफाइंग वॉटर ट्रे (बोतलबंद साफ /स्टेराइल पानी) रखें।

37.

प्लेट की तली गन्दी

प्लेट की रीडिंग फिर लेने से पहले आराम से प्लेट की तली साफ़ कर लें

38.

वेलों में बुलबुले

सुनिश्चित करें कि प्लेट में रीडिंग से पहले बुलबुले न हों

39.

एज इफ़ेक्ट

सुनिश्चित करें कि प्लेट और सभी रिएजेंट कमरे के तापमान पर स्टोर किए गए हैं।

40.

स्टोरेज

सुनिश्चित करें कि सभी रिएजेंट और सैंपलो को सही तापमान पर स्टोर किया गया है।

41.

कैप्चर एंटीबॉडी प्लेट से बाइंड नहीं हुईं

सुनिश्चित कर लें कि आप एलिसा प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, न कि टिश्यू कल्चर प्लेट का। एंटीबॉडी को PBS में डाइल्यूट करें। कोटिंग और ब्लॉकिंग चरण दोनों के सही प्रिपरेशन और इनक्यूवेशन के समय को सुनिश्चित कर लें।

42.

प्रोटोकॉल में भिन्नता

अपने परीक्षण के साथ आए प्रोटोकॉल का ही उपयोग करें

43.

स्टैण्डर्ड ग्राफ की गलत कैलकुलेशन/गणना

गणनाओं को चेक करें, नया स्टैंडर्ड ग्राफ बनाएं & आंतरिक कंट्रोलों का उपयोग करें

44.

दूषित बफर

फ्रेश बफर उपयोग करें

45.

वेल की तली खुरच गयी

पिपेटिंग के दौरान वेल की तली को छूने से बचें। तली को खराब होने से बचाने के लिए पिपेट की टिप को वेल की दीवार पर लगाएं।

46.

बैकग्राउंड वेल का दूषित होना

सीलर को ठीक से उपयोग करके वेल के आपस में कंटामिनेशन से बचें। प्लेट में रिएजेंट को छुए बिना मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।

47.

उपयोग की गई मैट्रिक्स में एंडोजीनस एनालाइट या इंटरफेरेंस का होना

क्रॉस रिएक्ट करने वाले घटकों (जैसे कि इंटरल्यूकिन संशोधित टिशू कल्चर मीडियम) के लिए मैट्रिक्स अवयवों की जाँच करें।

48.

कम वॉश

वॉश की संख्या बढ़ाएं। सब्सट्रेट सॉल्यूशन के डालने से पहले वॉश के बीच भिगोने का समय बढ़ाएँ।

49.

क्रॉस-रिएक्टिविटी

डिटेक्शन एंटीबॉडी कोटिंग एंटीबाडी के साथ क्रॉस-रिएक्ट कर रही है। उचित कंट्रोल चलाएं।

50.

एंटीबॉडी की नॉन-स्पेसिफिक बाइंडिंग

सुनिश्चित करें कि एक ब्लॉक कदम शामिल है और एक उपयुक्त ब्लॉकिंग बफर का उपयोग किया जा रहा है। हम एक ही प्रजाति से सेकेंडरी एंटीबॉडी, या 5 से 10% बोवाइन सीरम का उपयोग करने की सलाह देते हैं। सुनिश्चित करें कि नॉनस्पेसिफिक अटैचमेंट को रोकने के लिए वेल को पहले से प्रोसेस किया गया है। एक एफिनिटी शुद्ध एंटीबॉडी जैसे कि पूर्व अवशोषित उपयोग करें

51.

दूसरी कन्जूगेटेड एंटीबॉडी की कंसंट्रेशन बहुत ज्यादा

ऑप्टीमल वर्किंग कंसंट्रेशन जानने के लिए डाइल्यूशन करें

52.

गलत परीक्षण तापमान

चेक करें कि इन्क्यूबेशन तापमान 37°C से ऊपर न जाए

53.

ठीक से वॉश नहीं किया गया

सुनिश्चित करें कि सभी वेल वॉश बफर से भरे हुए हैं और पूरी तरह से खाली किये जा रहे हैं। अगर उपलब्ध हो तो ऑटोमैटिक प्लेट वॉशर उपयोग करें। वॉश की संख्या बढाएं। वॉश के बीच में 30 सेकंड भिगोने का चरण डालें।

54.

सैंपल में दूषित करने वाले एंजाइम की उपस्थिति

कंटामिनेट कर रहे एंजाइम की गतिविधि की जांच करने के लिए सैंपल को अकेले सब्सट्रेट के साथ परीक्षण करें।

55.

वेल को ठीक से वॉश नहीं किया गया

वेल को प्रोटोकॉल के अनुसार वॉश करें

56.

दूषित वॉश बफर

बफर फ्रेश बनाएं

57.

बहुत ज्यादा डिटेक्शन रिएजेंट

सुनिश्चित कर लें कि रिएजेंट ठीक से डाइल्यूट हुआ है या डिटेक्शन रीएजेंट का सुझाई गई कंसंट्रेशन घटा दें

58.

अप्रभावी ब्लॉकिंग बफर

अन्य ब्लॉकिंग रिएजेंट आजमायें और/या वॉश बफर में ब्लॉकिंग रिएजेंट मिलाएं

59.

इन्क्यूबेशन/वॉश बफर का साल्ट कंसंट्रेशन

सॉल्ट कंसंट्रेशन बढ़ाना नॉन-स्पेसिफिक और/या वीक ऑफ-टारगेट इंटरेक्शन घटा देता है।

60.

स्टॉप सॉल्यूशन डालने के बाद प्लेट को पढ़ने तक बहुत इंतजार करना

स्टॉप सॉल्यूशन डालने के तुरंत बाद प्लेट को रीड करें

61.

हाई एंटीबॉडी कंसंट्रेशन

ऑप्टीमल परिणामों के लिए अलग डाइल्यूसन आजमाएं

62.

सब्सट्रेट का इन्क्यूबेशन प्रकाश में किया

सब्सट्रेट का इन्क्यूबेशन अंधेरे में होना चाहिए या जैसे उत्पादक ने बताया हो।

63.

सब्सट्रेट डालने पर वेल में प्रेसिपीटेट बनना

सब्सट्रेट का डाइल्यूसन फैक्टर बढ़ाएं या सब्सट्रेट का कंसंट्रेशन घटायें

64.

गन्दी प्लेट

पोंछे से प्लेट की तली को साफ करें

65.

गलत या कोई डिटेक्शन एंटीबॉडी नहीं डाली गई

उचित डिटेक्शन एंटीबॉडी डालें और आगे जारी रखें

66.

एविडिन-HRP नहीं मिलायी गई

प्रोटोकॉल के अनुसार एविडिन -HRP डालें और आगे जारी रखें

67.

सब्सट्रेट सॉल्यूशन नहीं डाला गया

सब्सट्रेट सॉल्यूशन डालें और आगे जारी रखें

68.

वॉश बफर में अजाइड उपस्थित

वॉश बफर में सोडियम अजाइड से बचें

69.

बहुत कम समय तक इन्क्यूबेशन

सैंपल को रातभर 4’C पर इनक्यूबेट करें या उत्पादक की गाइडलाइन का पालन करें

70.

टारगेट का परीक्षण की डिटेक्शन लिमिट से कम होना

डाइल्यूशन फैक्टर घटायें या सैंपल को कंसन्ट्रेट करें

71.

अनुचित/इनकम्पेटिबल सैंपल का प्रकार

बिना टेस्ट किए सैंपलों में डिटेक्शन घट सकता है या अनुपस्थित हो सकता है परीक्षण में एक पॉजिटिव कंट्रोल सैंपल को शामिल करें

72.

अब्जोर्प्शन प्लेट में बंधे एपीटोप को पहचानना

डायरेक्ट या इनडायरेक्ट एलिसा से पेप्टाइड डिटेक्शन बढ़ाने के लिए माइक्रोटाइटर प्लेट कर कोट करने से पहले पेप्टाइड को बड़े कैरियर प्रोटीन से कन्जूगेट करा दें

73.

गलत परीक्षण बफर

सुनिश्चित कर लें कि परीक्षण का बफर रूचि के टारगेट के अनुकूल है (जैसे एंजाइमैटिक एक्टिविटी रह जाना, प्रोटीन इंटरेक्शन रह जाना।)

74.

अपर्याप्त डिटेक्शन रिएजेंट

उत्पादक की गाइडलाइन के अनुसार डिटेक्शन रिएजेंट के कंसंट्रेशन की मात्रा को बढ़ाएं

75.

गलत बनाया गया सैंपल

ठीक से सैंपल की प्रिपरेशन/डायल्यूशन को सुनिश्चित करें। सैंपल माइक्रोटाइटर प्लेट परीक्षण प्रारूप के साथ असंगत/इनकम्पेटिबल हो सकता है

76.

अपर्याप्त एंटीबॉडी

एंटीबॉडी की अलग-अलग कंसंट्रेशन/डाइल्यूशन आजमायें

77.

इन्क्यूबेशन तापमान बहुत कम है

सुनिश्चित करे कि इन्क्यूबेशन सही तापमान पर किए जाएँ। शुरू होने से पहले प्लेट को मिलाकर सभी रिएजेंट कमरे के तापमान पर या उत्पादक द्वारा अनुशंसित तापमान पर होने चाहिए

78.

गलत वेवलेंथ/तरंग्धैर्य

वेवलेंथ/तरंग्धैर्य को जांचें और फिर से प्लेट पढ़ें

79.

तेजी से की गई प्लेट वॉशिंग

आटोमेटिक प्लेट वॉशर में सही प्रेशर चेक करें। अगर वॉश मैन्युअली की जा रही हैं तो प्लेट वॉश बफर को हल्के से इस्तेमाल करें।

80.

वेल सूखना

परीक्षण शुरू होने के बाद वेल को सूखने न दें। सभी इनक्यूबेशन के लिए प्लेट को सीलिंग फिल्म या टेप इस्तेमाल करके कवर कर दें।

81.

एंजाइमैटिक प्रतिक्रियाओं से रंग धीमे आना

सब्सट्रेट सॉल्युशन को इस्तेमाल से पहले तुरंत बनाएं। सुनिश्चित कर लें कि स्टॉक सॉल्युशन की समय सीमा समाप्त या दूषित नहीं हुआ है। लंबा इन्क्यूबेशन होने दें।

82.

असमान रंग

सुनिश्चित कर लें कि सभी वेल अच्छे से वॉश हुए हों, जहाँ संभव हो एलिसा प्लेट वॉशर का इस्तेमाल करें

83.

परीक्षण की शुरूआत से सभी रिएजेंट कमरे के तापमान पर होने चाहिए। बेंच पर 15-20 मिनट के बाद कमरे का तापमान हो जाना चाहिए।

84.

रिएजेंट की समय सीमा समाप्त हो गई

सुनिश्चित करें कि उपयोग किए गए सभी रिएजेंट तारीख के अंदर हैं

85.

परीक्षण का प्रारूप पर्याप्त सेंसिटिव नहीं है

ज्यादा सेंसिटिव परीक्षण (उदाहरण डायरेक्ट एलिसा को सैंडविच एलिसा में) में बदलें
इंक्यूबेशन के समय को बढ़ाएं या तापमान बढ़ाएं। अथवा डिटेक्शन का तरीका बदलें।

86.

एंटीबॉडी को घोलने के लिए FCS वाला बफर उपयोग किया गया

उपयोग किए गए रिएजेंट को फिर से चेक करें

87.

स्टैंडर्ड ठीक से नहीं बनाया गया या ठीक से स्टोर नहीं किया गया

स्टैंडर्ड को दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार बनाएं और स्टोरेज के निर्देशों का पालन करें

88.

रिएजेंट की गलत कंसंट्रेशन वेल में डाली गई

पिपेटिंग त्रुटियों को चेक करें और रिएजेंट के वॉल्यूम को सही करें

89.

गलत तापमान पर इन्क्यूबेट किया गया

स्टोरेज, इन्क्यूबेशन और मिलाने के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें

90.

वेल को पूरी तरह खाली नहीं किया गया

चरणों के बीच पूरी तरह से खाली करें, संभव हो तो प्लेट को वॉश करें

91.

इन्क्यूबेशन के दौरान प्लेटों को स्टैक में रखा गया

प्लेटों को अलग रखें

92.

खराब डायल्यूशन श्रंखला

डायल्यूशन के चरणों को प्रोटोकॉल के अनुसार चेक करें

93.

रिएजेंट ठीक से नही मिलाया

सुनिश्चित करें कि रिएजेंट को ठीक से मिलाया गया है

94.

प्लेट में ख़राब या भिन्न ऐडजोर्पशन रिएजेंट का डालना

आमतौर पर PBS pH 7.4 या कार्बोनेट बाईकार्बोनेट बफर pH 9.6 कोटिंग बफर चुनें। इन्क्यूबेशन के समय को बढ़ाएं या दूसरी प्लेट उपयोग करने पर विचार करें

95.

स्टैंडर्ड नष्ट हो गया

चेक करें कि स्टैंडर्ड ठीक से स्टोर किया गया था

96.

ग्राफ स्केल में फिट नहीं होता है

अलग स्केल उदाहरण के लिए log-log, 5 पैरामीटर लोजिस्टिक ग्राफ फिट रहता है

97.

पिपेटिंग की त्रुटि

पिपेट चेक करें और कैलिब्रेट करें

98.

कैप्चर एंटीबॉडी प्लेट से बाइंड नहीं की

सुनिश्चित करें टिश्यू कल्चर प्लेट नहीं बल्कि एलिसा प्लेट उपयोग कर रहे हैं।

99.

अपर्याप्त डिटेक्शन एंटीबॉडी

डाइल्यूसन चेक करें, यदि जरूरी हो तो टाइट्रेट करें

100.

स्टैण्डर्ड ग्राफ डायल्यूशन की गलत गणना

अपनी गणना को चेक करें और नया ग्राफ बनाएं

101.

अलग किट से रिएजेंट को मिलाया या बदला गया

इससे बचें क्योंकि यह आपके परीक्षण की क्वालिटी को प्रभावित कर सकता है