101 Dicas para Solução de Problemas do ELISA

101 Dicas para Solução de Problemas do ELISA

O nosso guia de 101 dicas de solução de problemas do ELISA está concebido para ajudá-lo a melhorar e a solucionar os problemas comuns que os investigadores têm com seus kits ELISA ao realizar ensaios. A otimização do seu ELISA e a remoção de erros comuns podem melhorar drasticamente os seus resultados e a sensibilidade dos seus ensaios ELISA. Neste guia de solução de problemas do ELISA, detalhamos as áreas comuns onde os investigadores encontram problemas com o seu ELISA.

Principais áreas de solução de problemas do ELISA:

Sinal elevado:

O sinal elevado pode ocorrer por inúmeras razões, incluindo a lavagem insuficiente da placa, não interromper a reação e adicionar demasiado reagente de deteção. Se tiver um sinal elevado, isso pode resultar em muitos falsos positivos e dados incorretos.

Fora do limite

Às vezes isto pode acontecer com base nas suas amostras, lavagem insuficiente ou incorretas diluições preparadas. Isto pode resultar em perda de dados devido a resultados negativos ou nenhuns resultados.

Variação Elevada:

Alta variação pode ser devida a erros de preparação da amostra, erros de pipeta e inconsistências, agitação insuficiente da placa, entre outros problemas. Dados com alta variação podem distorcer os resultados reais e causar inconsistências nos seus dados.

O fundo é alto

Um fundo alto pode resultar de etapas inadequadas de lavagem, reatividade cruzada de amostras ou contaminação. Mais uma vez, um fundo alto pode resultar em dados positivos/negativos falsos e afetar os seus resultados.

Sem Sinal

Nenhum sinal no seu ensaio ELISA pode resultar de numerosos problemas de amostra e ensaio, incluindo tampão de lavagem contendo azida, alvo abaixo da deteção do ensaio ou avidina-HRP não foi adicionada. Nenhum sinal pode significar nenhum resultado de amostras preciosas. Leia as razões abaixo para evitar estes problemas.

Baixa Curva Padrão

Uma curva padrão baixa comprovará resultados impublicáveis se não for preparada corretamente. As razões podem incluir reagentes mal misturados, o padrão degradado ou erros de pipetagem.

	Solução de problemas para sinal elevado de ELISA
1.	A solução de substrato TMB estava contaminada	Use uma solução fresca de substrato TMB, que deve ser clara e incolor antes da adição aos poços. Use um recipiente limpo de fundo V antes de pipetar a solução de substrato para os poços.
2.	Reação não parada	A cor continuará a desenvolver-se se a reação do substrato não for interrompida.
3.	Placa deixada muito tempo antes de leitura no leitor de placas	A cor continuará a desenvolver-se (embora numa taxa mais lenta se a solução de paragem tiver sido adicionada).
4.	Contaminantes de objetos de vidro de laboratório	Certifique-se de que os reagentes são recentes e preparados em objetos de vidro limpos.
5.	Incubação de substrato realizada à luz	A incubação do substrato deve ser realizada no escuro. Assegure-se de que o substrato não está exposto à luz - armazene-o num local escuro. Limite a exposição à luz durante a execução do ensaio.
6.	Poços estão insuficientemente lavados	Lave os poços conforme as recomendações do protocolo.
7.	Demasiado reagente de deteção adicionado	Certifique-se de que o reagente foi diluído adequadamente ou diminua a concentração recomendada do reagente de deteção.
8.	Tampão de bloqueio ineficaz (por exemplo, o reagente de deteção liga-se ao bloqueador; os poços não estão completamente bloqueados)	Experimente reagente de bloqueio diferente e/ou adicione reagente de bloqueio para lavar o tampão.
9.	Concentração de sal nos tampões de incubação/lavagem	Concentrações salinas crescentes podem reduzir interações não-específicas e/ou fracas com o alvo.
10.	Elevada concentração de anticorpos	Tente diferentes diluições para obter melhores resultados.
11.	Precipitado formado nos poços após adição de substrato	Aumente o fator de diluição da amostra ou diminuir a concentração do substrato.
12.	Placa suja	Limpe o fundo da placa.
13.	Diluições de curva padrão incorretamente preparadas	Verifique a sua técnica de pipetagem. A calibração de pipetas pode ser necessária.
14.	Tempos de incubação mais longos do que os recomendados	Certifique-se de que os seus tempos de incubação estão corretos e cumpra o protocolo fornecido com o manual técnico
15.	Seladores de placas ou reservatórios de reagentes reutilizados, resultando na presença de HRP residual. Isso irá tornar o TMB azul de forma não específica.	A reutilização de selantes da placa pode levar à presença de HRP residual, levando a uma mudança de cor não específica do TMB. Para evitar isso, use um selador de placa novo e um reservatório de reagente para cada etapa
16.	Contaminação de tampões	Tenha sempre tampões novos.
	Solução de problemas do ELISA para Fora do Limite
17.	As amostras não contêm ou contêm níveis inferiores detetáveis ​​de analito	Se as amostras estiverem abaixo dos níveis detetáveis, pode ser possível usar uma amostra de volume alto. Consulte o suporte técnico para modificações apropriadas de protocolo.
18.	As amostras contêm concentrações de analito superiores ao ponto padrão mais alto	As amostras podem exigir diluição adicional.
19.	Lavagem insuficiente	Use o procedimento de lavagem apropriado - veja abaixo. No final de cada etapa de lavagem, inverta a placa no tecido absorvente e deixe escorrer completamente, batendo com força, se necessário, para remover qualquer fluido residual.
20.	Seladores de placa não usados ​​ou reutilizados	Durante as incubações, cubra as placas de ensaio com selantes de placa. Use um selante novo cada vez que a placa for aberta. Isso evitará que os poços se contaminem mutuamente.
21.	Diluições incorretamente preparadas	Verifique a técnica de pipetagem - veja abaixo - e confirme os cálculos.
22.	Tempos de incubação mais longos do que os recomendados	Kits fabricados têm protocolos otimizados. Certifique-se de seguir os tempos de incubação recomendados. Se estiver a desenvolver o ELISA usando pares de anticorpos, talvez seja necessário otimizar o ensaio. Para mais informações, veja Desenvolvimento e Otimização Elisa.
23.	Solução de substrato misturada cedo demais, tendo ficado azul	A solução de substrato deve ser misturada e usada imediatamente.
24.	Demasiada estreptavidina-HRP	Verificar a diluição, dosear, se necessário.
25.	Seladores de placas ou reservatórios de reagentes reutilizados, resultando na presença de HRP residual. Isso irá tornar o TMB azul de forma não específica.	Para evitar isso, use um selador de placa novo e um reservatório de reagente para cada etapa.
26.	Tampões contaminados com metais ou HRP	Tenha sempre tampões novos.
	Solução de problemas do ELISA para Variação Elevada
27.	Erros de pipeta multicanal	Calibre as pipetas.
28.	A lavagem da placa não foi adequada ou uniforme	Certifique-se de que as pontas das pipetas estão bem fixadas. Confirme se todos os reagentes foram completamente removidos em todos os passos da lavagem.
29.	Amostras não homogéneas	Misture cuidadosamente as amostras antes de pipetar.
30.	As amostras podem ter alto teor de partículas	Remova o teor de partículas por centrifugação.
31.	Agitação insuficiente da placa	A placa deve ser agitada durante todas as etapas de incubação, usando um agitador de placas ELISA, a uma velocidade onde as soluções nos poços estejam em constante movimento sem salpicar.
32.	Contaminação entre poços	Ao reutilizar os selantes de placa, verifique se nenhum reagente tocou o selante. Deve ter-se cuidado ao usar as mesmas pontas de pipeta utilizadas para adições de reagentes. Certifique-se de que as pontas das pipetas não tocam os reagentes na placa.
33.	Placas empilhadas durante as incubações	O empilhamento de placas não permite uma distribuição uniforme da temperatura nos poços das placas. Evite empilhar.
34.	Pipeta inconsistente	Assegure-se de que as pipetas estão a funcionar corretamente e estão calibradas. Certifique-se de que as pontas das pipetas são empurradas para longe o suficiente para criar uma boa vedação. Tome especial cuidado ao diluir a placa e observe se as pontas das pipetas estão a pegar e a libertar a quantidade correta de líquido.
35.	Diluições/reagentes de anticorpos não estão bem misturados	Para garantir uma concentração consistente em todos os poços, certifique-se de que todos os reagentes e amostras são misturados antes de pipetar nas placas.
36.	Poço permitido secar	Certifique-se de que as tampas são deixadas nas placas o tempo todo durante a incubação. Coloque uma bandeja de água humidificadora (água engarrafada limpa / esterilizada) na parte inferior da incubadora.
37.	A parte inferior da placa está suja	Limpe o fundo da placa com cuidado antes de reler as placas.
38.	Bolhas nos poços	Certifique-se de que não há bolhas antes de ler a placa.
39.	Efeitos laterais	Certifique-se de que a placa e todos os reagentes estão à temperatura ambiente.
40.	Armazenamento	Assegure-se de que os reagentes e as amostras estão armazenados à temperatura correta.
41.	O anticorpo de captura não se ligou à placa	Certifique-se de que está a usar uma placa ELISA, não uma placa de cultura de tecidos. Dilua o anticorpo em PBS. Garanta a preparação e o tempo de incubação corretos para as etapas de revestimento e bloqueio.
42.	Variações em protocolos	Adira ao protocolo que acompanha o seu ensaio.
43.	Cálculos impróprios da curva padrão	Verifique os cálculos, faça uma nova curva padrão e use controles internos.
44.	Tampões contaminados	Use tampões novos.
45.	Fundo do poço desfeito	Evite o contacto com o fundo do poço durante a pipetagem. Aponte a ponta da pipeta para o lado do poço para evitar perturbar o fundo.
	Solução de problemas do ELISA para O fundo é alto
46.	Os fundos dos poços foram contaminados	Evite a contaminação entre poços usando adequadamente o selante. Use pipetas multicanais sem tocar nos reagentes na placa.
47.	A matriz usada tem analito ou interferência endógena	Verifique os ingredientes da matriz quanto a componentes de reação cruzada (por exemplo, meio de cultura de tecidos modificado com interleucina).
48.	Lavagens insuficientes	Aumente o número de lavagens. Aumente o tempo de imersão entre lavagens antes da adição da solução de substrato.
49.	Reatividade cruzada	Anticorpo de deteção com reatividade cruzada com o anticorpo de revestimento. Execute os controles apropriados.
50.	Ligação não específica de anticorpos	Certifique-se de que uma etapa de bloco está incluída e que um tampão de bloqueio adequado está a ser usado. Recomendamos o uso de 5 a 10% de soro da mesma espécie do anticorpo secundário ou soro bovino. Certifique-se de que os poços são pré-processados ​​para evitar a ligação não específica. Use um anticorpo purificado por afinidade, de preferência pré-absorvido.
51.	Concentração de segundo anticorpo conjugado muito elevada	Realize diluições para determinar a concentração ideal do trabalho.
52.	Temperatura incorreta do ensaio	Verifique se a temperatura de incubação não excedeu 37°C
53.	Lavagem inadequada	Certifique-se de que todos os poços estão a encher com tampão de lavagem e estão a ser aspirados completamente. Use uma máquina de lavagem automática de placas, se disponível. Aumente o número de lavagens. Adicione 30 segundos na etapa de imersão entre as lavagens.
54.	Enzimas contaminantes presentes na amostra	Teste a amostra apenas com substrato para verificar a atividade da enzima contaminante.
55.	Poços estão insuficientemente lavados	Lave os poços conforme as recomendações do protocolo.
56.	Tampão de lavagem contaminado	Prepare tampões novos.
57.	Demasiado reagente de deteção adicionado	Certifique-se de que o reagente foi diluído adequadamente ou diminua a concentração recomendada do reagente de deteção
58.	Tampão de bloqueio ineficaz	Experimente reagente de bloqueio diferente e/ou adicione reagente de bloqueio para lavar o tampão
59.	Concentrações de sal nos tampões de incubação/lavagem	Concentrações salinas crescentes podem reduzir interações não-específicas e/ou fracas com o alvo.
60.	Esperar demasiado tempo para ler a placa após a adição da solução de paragem	Leia a placa imediatamente após adicionar solução de paragem.
61.	Elevada concentração de anticorpos	Tente diferentes diluições para obter melhores resultados.
62.	Incubação de substrato realizada à luz	Incubações de substrato devem ser realizadas no escuro ou como recomendado pelo fabricante.
63.	Precipitado formado nos poços após adição de substrato	Aumente o fator de diluição da amostra ou diminua a concentração do substrato.
64.	Placa suja	Limpe o fundo da placa com um pano.
	Solução de problemas do ELISA para Sem Sinal
65.	Anticorpo incorreto ou sem deteção foi adicionado	Adicione o anticorpo de deteção apropriado e continue.
66.	Avidina-HRP não foi adicionada	Adicione avidina-HRP de acordo com o protocolo e continue.
67.	Solução de substrato não foi adicionada	Adicione a solução de substrato e continue.
68.	Tampão de lavagem contém azida	Evite azida sódica no tampão de lavagem.
69.	Tempo de incubação demasiado curto	Incubar as amostras durante a noite a 4°C ou seguir as orientações do fabricante.
70.	Alvo presente abaixo dos limites de deteção do ensaio	Diminua o fator de diluição ou concentre as amostras.
71.	Tipo de amostra incompatível	A detecção pode ser reduzida ou ausente em tipos de amostras não testadas. Inclua uma amostra cujo ensaio é conhecido por detectar o controle positivo.
72.	Reconhecimento do epítopo impedido pela placa de absorção	Para aumentar a deteção de um peptídeo por ELISA direto ou indireto, conjugue o peptídeo com uma grande proteína transportadora antes de aplicar o revestimento numa placa de microtitulação.
73.	Incompatibilidade do tampão de ensaio	Certifique-se de que o tampão de ensaio é compatível com o alvo de interesse (por exemplo, atividade enzimática retida, interações de proteína retidas).
74.	Reagente de deteção insuficiente	Aumente a concentração da quantidade de reagente de deteção seguindo as orientações do fabricante.
75.	Amostra preparada incorretamente	Assegure a adequada preparação/diluição da amostra. As amostras podem ser incompatíveis com o formato de ensaio da placa de microtitulação.
76.	Anticorpo insuficiente	Tente diferentes concentrações/diluições de anticorpos.
77.	A temperatura de incubação é demasiado baixa.	Assegure-se de que as incubações são realizadas à temperatura correta. Todos os reagentes, incluindo a placa, devem estar à temperatura ambiente ou conforme recomendado pelo fabricante antes de prosseguir.
78.	Comprimento de onda incorreto	Verifique o comprimento de onda e leia a placa novamente.
79.	A lavagem da placa é muito enérgica	Verifique a pressão correta na lavagem automática de placas. Limpe cuidadosamente o tampão de lavagem com pipeta se as lavagens forem feitas manualmente.
80.	Poços secos	Não permita que os poços fiquem secos após o início do ensaio. Cubra a placa usando película ou fita de vedação para todas as incubações.
81.	Desenvolvimento de cor lenta das reações enzimáticas	Prepare a solução de substrato imediatamente antes de usar. Assegure-se de que a solução de reserva não expirou e não está contaminada. Permita uma incubação mais longa.
82.	Cor desigual	Certifique-se de que todos os poços são lavados corretamente. Use uma máquina de lavar placas ELISA sempre que possível.
83.	Reagentes não estão à temperatura ambiente	Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente, desde o início do ensaio. A temperatura ambiente deve ser alcançada após 15 a 20 minutos de repouso.
84.	Reagentes expirados	Assegure-se de que todos os reagentes utilizados estão dentro da data.
85.	Formato de ensaio insuficientemente sensível	Mude para um tipo de ensaio mais sensível (por exemplo, ELISA direto para ELISA sanduíche). Prolongue os tempos de incubação ou aumente a temperatura. Ou mude o método de deteção.
86.	Tampão contendo FCS utilizado para reconstituir anticorpos	Reavalie os reagentes utilizados.
	Solução de problemas do ELISA Baixa Curva Padrão
87.	O padrão foi reconstituído incompletamente ou foi armazenado incorretamente	Reconstitua o padrão de acordo com o protocolo fornecido e siga as instruções de armazenamento.
88.	Reagentes foram adicionados aos poços em concentrações incorretas	Verifique se há erros de pipetagem e corrija o volume do reagente.
89.	Incubações feitas a temperatura incorreta	Siga o protocolo para armazenamento, incubação e agitação.
90.	Poços não completamente aspirados	Aspire completamente entre as etapas; use a lavagem da placa sempre que possível.
91.	Placas empilhadas durante a incubação	Mantenha as placas separadas.
92.	Série de diluição fraca	Verifique os passos de diluição de acordo com o protocolo.
93.	Reagentes mal misturados	Certifique-se de misturar os reagentes cuidadosamente.
94.	Adsorção pobre ou variável de reagentes para placa	Verifique a escolha do tampão de revestimento, geralmente PBS com um pH de 7,4 ou tampão de carbonato-bicarbonato pH 9,6. Tente alargar este tempo de incubação ou considere o uso de placas diferentes.
95.	Padrão degradado	Verifique se o padrão foi armazenado corretamente.
96.	Curva não se adequa à escala	Tente traçar o uso de diferentes escalas, por exemplo, log-log, ajuste de curva logística de 5 parâmetros.
97.	Erro de pipetagem	Verifique as pipetas e calibre.
98.	O anticorpo de captura não se ligou à placa	Certifique-se de que está a usar uma placa ELISA, não uma placa de cultura de tecidos.
99.	Insuficiente deteção de anticorpo	Verificar a diluição, dosear, se necessário.
100.	Cálculo incorreto da diluição da curva padrão	Verifique os seus cálculos e faça uma nova curva.
101.	Misturando ou substituindo reagentes de kits diferentes	Evite isso, pois tal pode afetar a qualidade do seu ensaio.